結(jié)核分枝桿菌是全球發(fā)病和死亡的主要原因之一，由于耐多藥菌株的發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌正變得越來越令人擔(dān)憂。結(jié)核分枝桿菌會(huì)污染房間、醫(yī)療設(shè)備和研究實(shí)驗(yàn)室，而且對(duì)凈化具有很強(qiáng)的抵抗力。

本研究旨在評(píng)估在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中使用過氧化氫干霧（DHP）對(duì)房間進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌消毒的效果。生物指示劑（BIs）是預(yù)先滅菌的棉質(zhì)組織，上面含有約107 CFU/ml的結(jié)核分枝桿菌H37Ra。使用滅菌器設(shè)備為“美卓牌DHP消毒機(jī)”，使用7.5%的過氧化氫（舒博牌SP-007殺孢子劑），共進(jìn)行了三次實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，DHP在25分鐘內(nèi)存活細(xì)菌的減少超過5 log10，且所有生物指示劑均未出現(xiàn)任何菌落?？偟膩碚f，DHP有望成為甲醛的有效而安全的替代品。

DF-10A-杭州美卓生物科技有限公司

美卓生物干霧過氧化氫消毒機(jī)DF-10A詳細(xì)介紹資料。

結(jié)核分枝桿菌主要通過氣溶膠傳播，因此容易污染醫(yī)療機(jī)構(gòu)或?qū)嶒?yàn)室的房間。此外，這些細(xì)菌對(duì)消毒和熏蒸過程具有極強(qiáng)的內(nèi)在抵抗力，并擁有有效的氧化應(yīng)激防御機(jī)制。它們對(duì)消毒劑的抵抗被認(rèn)為介于其他細(xì)菌和芽孢之間，且導(dǎo)致這種高抗性的細(xì)胞壁成分尚不清楚，但霉菌醇酸和阿拉伯半乳聚糖似乎都與之有關(guān)。

杭州美卓生物科技有限公司|干霧過氧化氫（DHP）對(duì)結(jié)核分枝桿菌的功效，3級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室的例行凈化

美卓DF-10A

化學(xué)液體和蒸汽是常用的去污劑。傳統(tǒng)的熏蒸方法包括使用甲醛或環(huán)氧乙烷氣體，但由于其毒性和致癌性，這些方法已經(jīng)被淘汰。2004年6月，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將甲醛列為人類致癌物。法國(guó)自2006年9月建議不再將甲醛用于房間凈化，并于2007年1月停止生產(chǎn)。過氧化氫因其對(duì)各種微生物的生物效果和安全性而成為甲醛的替代品。

過氧化氫已被推薦用于多種材料的消毒，包括牙科器械和支氣管鏡。過氧化氫蒸汽（VHP）在生物安全柜（BSC）、衛(wèi)生保健設(shè)施、救護(hù)車、制藥設(shè)施和實(shí)驗(yàn)室的生物凈化中得到越來越廣泛的應(yīng)用。一些研究重點(diǎn)關(guān)注其在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL3）中對(duì)結(jié)核分枝桿菌或其他非結(jié)核分枝桿菌（NTM）的消毒效果。

在這項(xiàng)研究中，使用“美卓牌DHP消毒機(jī)”測(cè)試了過氧化氫（DHP）干霧，作為BSL3空氣和表面凈化的消毒劑。研究目的是評(píng)估DHP擴(kuò)散對(duì)清除實(shí)驗(yàn)室菌株M.tuberculosis H37Ra（一種無毒菌株）的效果。

材料和方法

生物指標(biāo)（BIs）的準(zhǔn)備

根據(jù)法國(guó)規(guī)范化協(xié)會(huì)的AFNOR 72-281和AFNOR 72-190標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，適用于生長(zhǎng)緩慢的分枝桿菌。M.tuberculosis H37Ra（ATCC 25177）在L?wenstein Jensen培養(yǎng)基（Bio-Rad）中進(jìn)行亞培養(yǎng)。亞培養(yǎng)15天后，使用滅菌蒸餾水制備細(xì)菌懸浮液，并將其調(diào)整為1 McFarland標(biāo)準(zhǔn)。每次實(shí)驗(yàn)在L?wenstein Jensen培養(yǎng)基上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，將100μl的懸浮液涂抹在風(fēng)干的11張預(yù)先滅菌的棉質(zhì)組織（4.5×3厘米）的中央。

BSL3實(shí)驗(yàn)室操作

試驗(yàn)在80米3的BSL3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，包括兩個(gè)二級(jí)生物安全柜（Securiplus M5142；Astec Microflow，英國(guó)）、冷凍箱和培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行了三個(gè)周期。每個(gè)周期中，將BI從玻璃管中取出，并放置在實(shí)驗(yàn)室的九個(gè)位置（A至I）：兩個(gè)在運(yùn)行中的生物安全柜中（前面板打開20厘米；平均流速0.45 m3/s），兩個(gè)在不同的培養(yǎng)箱中（一個(gè)封閉，一個(gè)通風(fēng)），五個(gè)在天花板上（在實(shí)驗(yàn)室中間和角落，一個(gè)在DHP儀器后面）（圖1）。BI與儀器的距離各不相同（1至9.5米）。為驗(yàn)證在BIs上培養(yǎng)和計(jì)數(shù)細(xì)菌的方法，并確保Mycobacteria細(xì)胞在這些處理后仍然存活，我們將兩個(gè)BIs用作對(duì)照，并在樣品接觸DHP的整個(gè)過程中一直保持在BSL3之外。房間內(nèi)的供暖、通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)被關(guān)閉，以防止DHP在接觸期間發(fā)生意外擴(kuò)散或稀釋。在接觸DHP兩小時(shí)后，系統(tǒng)恢復(fù)。開始擴(kuò)散前測(cè)量的室溫為20至23°C，相對(duì)濕度為45至50%。DHP消毒是通過使用7.5%濃度的過氧化氫消毒液（舒博牌SP-007殺孢子劑）的美卓?jī)x器進(jìn)行的，整個(gè)過程在25分鐘內(nèi)產(chǎn)生了100ppm的H2O2。

BSL3的示意圖，包括每個(gè)BI的位置

BIs的培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

將經(jīng)DHP暴露并在曝氣階段結(jié)束后一夜移出房間的9只BI和未經(jīng)DHP暴露的2只BI（對(duì)照組），轉(zhuǎn)移到裝有10毫升滅菌蒸餾水的塑料管中。在3分鐘內(nèi)進(jìn)行超聲波處理（2 W；頻率20 KHz）（美卓）。對(duì)回收的10毫升進(jìn)行稀釋（10-2）處理，使用滅菌蒸餾水。隨后，用0.45-μm過濾器（密理博公司，馬薩諸塞州貝德福德）過濾每種懸浮液（純的和10-2稀釋的），每種2毫升。過濾器用50毫升滅菌蒸餾水沖洗三次，然后放入添加了OADC（批號(hào)5188292；Becton Dickinson，Sparks，MD）的Middlebrook 7H11平板上。所有計(jì)數(shù)均按照相同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。CFU在37°C培養(yǎng)4周后進(jìn)行計(jì)數(shù)。超聲波處理后，將所有BI培養(yǎng)在Middlebrook 7H9肉湯（參考號(hào)271310，批號(hào)1298006；Becton Dickinson，Sparks，MD）中，以確保該技術(shù)能夠有效收集所有分枝桿菌，并且支架上沒有存活的分枝桿菌殘留。

結(jié)果

表1列出了三次DHP擴(kuò)散暴露的結(jié)果。在L?wenstein Jensen培養(yǎng)基上，運(yùn)行1、2和3的初始懸浮液計(jì)數(shù)分別為106、108和107CFU/ml。

樣本、地點(diǎn)運(yùn)行1運(yùn)行2運(yùn)行3

細(xì)菌計(jì)數(shù)（CFU/毫升）增長(zhǎng)細(xì)菌計(jì)數(shù)（CFU/毫升）增長(zhǎng)細(xì)菌計(jì)數(shù)（CFU/毫升）增長(zhǎng)

未暴露對(duì)照1 5×105是5×106是5×105是

未暴露的對(duì)照組2 5×105是5×106是5×106是

A,運(yùn)行中的BSC 1 0沒有0沒有0沒有

B，運(yùn)行中的BSC 2 0沒有0沒有0沒有

C，在VHP機(jī)器后面0沒有0沒有0沒有

D，距儀器9.5米0沒有0沒有0沒有

E，出口門上0沒有50沒有0沒有

F，距離儀器5米0沒有0沒有0沒有

G，上述儀器0沒有0沒有0沒有

H，在培養(yǎng)箱中0沒有50沒有0沒有

I，在孵化器中0沒有0沒有0沒有

表1使用DHP后每毫升細(xì)菌總數(shù)a

BIs培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

我們?cè)贚owenstein Jensen培養(yǎng)基上對(duì)所有初始懸浮液進(jìn)行了菌落計(jì)數(shù)，以評(píng)估應(yīng)用于BIs的M.tuberculosis H37Ra的數(shù)量。我們將這些初始值視為理論初始濃度。在三項(xiàng)檢測(cè)中，初始接種物值介于106和108 CFU/ml之間。盡管采取了所有可能的預(yù)防措施，并使用McFarland標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)量，但這一差異凸顯出很難獲得均勻的分枝桿菌懸浮液?？紤]到超聲波對(duì)分枝桿菌細(xì)胞分離的效果，以及分枝桿菌細(xì)胞在BI上干燥24小時(shí)后存活率可能降低，未暴露于DHP的BI所獲得的細(xì)菌數(shù)被視為實(shí)際濃度。未暴露的BI中的細(xì)菌數(shù)量在5×105到5×106 CFU/ml之間（取決于初始接種量）。在所有實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到大約1-log10的下降，但在所有情況下，我們從對(duì)照組中獲得了至少5×105 CFU/ml，這使我們能夠注意到其他BIs有5-log10的下降。

在第一輪實(shí)驗(yàn)中，觀察到在37°C下暴露于DHP 6周后的樣品比初始接種量減少了超過5個(gè)對(duì)數(shù)值10（在7H11平板上的過濾器上沒有菌落生長(zhǎng)）。在37°C下培養(yǎng)6周后，在7H9肉湯中亞培養(yǎng)的棉花組織沒有生長(zhǎng)。這證實(shí)了超聲波技術(shù)能有效地將有活力的分枝桿菌從BIs中分離出來，DHP是一種有效的去污工具。

在第二輪實(shí)驗(yàn)中，觀察到了相同的結(jié)果，但有兩個(gè)例外。一些Mycobacteria細(xì)胞留在了BI E上（生長(zhǎng)了一個(gè)菌落，相當(dāng)于50 CFU/ml）。這可以用BI和儀器之間的距離以及兩個(gè)元件之間的障礙物數(shù)量來解釋。BI H上也長(zhǎng)出了一個(gè)菌落，但與最初的懸浮液相比，數(shù)量大大減少（50 CFU/ml對(duì)107 CFU/ml）。這令人不安，因?yàn)檫@可能意味著DHP進(jìn)入了培養(yǎng)箱，從而改變了培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)物。然而，在37°C溫度下培養(yǎng)6周后，在7H9肉湯中亞培養(yǎng)的棉花組織沒有生長(zhǎng)。

在第三輪實(shí)驗(yàn)中，暴露于二甲基亞砜的樣品在37°C溫度下培養(yǎng)6周后，其菌落數(shù)下降了5 log10以上，而且沒有一種生物活性成分在移栽培養(yǎng)物中產(chǎn)生菌落。

在三項(xiàng)檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)比初始接種量減少了5 log10以上。這些結(jié)果表明，DHP在室內(nèi)的擴(kuò)散是有效的，而且短時(shí)間（25分鐘）的暴露足以使BI失活。

結(jié)論

生物凈化所面臨的挑戰(zhàn)是找到一種能夠觸及各處感染性微粒的產(chǎn)品。DHP擴(kuò)散似乎是甲醛熏蒸的一個(gè)很好的替代品，特別是在BSL3級(jí)凈化中。根據(jù)AFNOR 72-281和72-190標(biāo)準(zhǔn)，至少要使初始接種體減少5-log10，才能確定去污劑是否有效。對(duì)Mycobacteria抗氧化能力的體外研究結(jié)果表明，低濃度的H2O2（10-100ppm）就可以有效殺死細(xì)菌。因此，本報(bào)告中描述的DHP擴(kuò)散系統(tǒng)使用7.5%H2O2（舒博牌SP-007殺孢子劑）溶液產(chǎn)生干霧，并將室內(nèi)干霧維持在80-100ppm。

在我們的研究中，我們使用的是美卓干霧消毒設(shè)備，它可以實(shí)現(xiàn)DHP。如前所述，結(jié)核桿菌具有很強(qiáng)的污染性，因?yàn)樗軌蛐纬蓺馊苣z，然后在環(huán)境中廣泛彌散到所有物體表面。使用酒精擦拭布和噴霧劑進(jìn)行人工消毒只能處理容易接觸到的區(qū)域。DHP擴(kuò)散工藝是一種有用的工具，因?yàn)樗母伸F中含有H2O2，這些帶電粒子的尺寸非常?。ㄖ睆郊s為10μm），可以作為干氣溶膠在空氣中自由流通。因此，DHP擴(kuò)散劑適合用于消除BSL3的污染。在本文介紹的研究結(jié)果中，我們?cè)谌?xiàng)獨(dú)立的試驗(yàn)中證明了這一過程對(duì)M.tuberculosis H37Ra的高效性，在無需人工干預(yù)的自動(dòng)模式下，熏蒸周期僅為25分鐘。在這些條件下，DHP擴(kuò)散法能有效殺死結(jié)核桿菌。

這證明了VHP處理是消除M.tuberculosis H37Rv室內(nèi)污染的有效手段。接觸DHP后，沒有發(fā)現(xiàn)任何表面或材料損壞。我們的研究提出的一個(gè)問題是，H2O2霧是否會(huì)滲入培養(yǎng)箱。我們的研究有效地表明，所有BI（包括培養(yǎng)箱中的BI）上的CFU都減少了。如果在BSL3中發(fā)生污染事故，所有培養(yǎng)物都無法轉(zhuǎn)移到其他培養(yǎng)箱中，而且如果H2O2霧滲透到培養(yǎng)箱中，分枝桿菌細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生變化。為了證實(shí)這一觀察結(jié)果，還必須進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)。

總之，我們的研究表明，美卓的DHP可有效凈化BSL3中的結(jié)核桿菌。為了避免使用致癌物質(zhì)甲醛，DHP擴(kuò)散技術(shù)是一種很有前途的房間和研究實(shí)驗(yàn)室（如BSL3）凈化方法。然而，我們只測(cè)試了一種M.tuberculosis菌株（H37Ra），它與毒性菌株H37Rv具有相同的特征，包括對(duì)抗生素的敏感性。這是我們研究的主要局限性。實(shí)際上，在BSL3中可以培養(yǎng)出大量的分枝桿菌菌株，包括耐多藥菌株。一些研究發(fā)現(xiàn)，一些非結(jié)核分枝桿菌對(duì)消毒劑的耐藥性強(qiáng)于結(jié)核分枝桿菌。即使對(duì)免疫力較高的實(shí)驗(yàn)室工作人員來說，非結(jié)核分枝桿菌的危險(xiǎn)性較低，但對(duì)其他Mycobacteria或非結(jié)核分枝桿菌（例如，經(jīng)常從臨床標(biāo)本中分離出的復(fù)合分枝桿菌或膿腫分枝桿菌菌株）進(jìn)行評(píng)估也是很有意義的。